Papel de la helicasa UAP56/DDX39B y otros factores asociados al metabolismo del ARN en la integridad del genoma

Resumo

Para la transmisión fidedigna de la información genética es indispensable preservar la integridad del genoma. Las células han desarrollado procesos complejos altamente regulados que velan por la estabilidad del mismo, evitando o resolviendo problemas que puedan comprometerla. La causa de dicha inestabilidad genética no sólo radica en la acción de agentes genotóxicos externos, sino también en aquellos derivados del propio metabolismo celular, resultado de fallos en los propios procesos endógenos de la célula como la transcripción, replicación y recombinación. La manifestación de la inestabilidad genética se presenta generalmente en forma de mutaciones y reordenaciones cromosómicas, características asociadas a la predisposición a envejecimiento y procesos tumorales. Paradójicamente, uno de los procesos más esenciales para la supervivencia de la célula, la transcripción, puede constituir a su vez una de las fuentes más importantes de inestabilidad genética. Esto se debe principalmente a la aparición de ADN de cadena sencilla durante su desarrollo, que es más susceptible a sufrir daños que el ADN de doble cadena. Asimismo, la propia maquinaria de transcripción puede suponer un obstáculo para otro proceso esencial en la célula como es la replicación, pudiendo derivar todo ello en un aumento de roturas y recombinación en el ADN. Durante la transcripción, el ARN naciente puede hibridar con la hebra molde de ADN, de manera que la hebra no transcrita se mantiene en forma de cadena sencilla. Estas estructuras generadas se conocen como bucles R (R loops) y están compuestos por un híbrido de ADN-ARN y la cadena sencilla de ADN desplazada. Si bien se ha demostrado que los R loops pueden desempeñar funciones fisiológicas importantes, cuando se forman o acumulan de manera incontrolada pueden suponer una amenaza para la integridad del genoma. El ARNm naciente ha de ser correctamente empaquetado en forma de ribonucleoproteínas mensajeras (mRNPs) para la elongación de la transcripción, la integridad y el procesamiento del ARNm, previo a su transporte al citoplasma. Dicho ARNm, como sustrato potencial en la formación de R loops, ha de ser pertinentemente procesado, empaquetado y protegido para evitar que hibride con el ADN molde. Es por ello que, durante su procesamiento, existen numerosos factores que se unen al ARNm y contribuyen a proteger el genoma de la formación de R loops. En esta tesis nos hemos centrado en factores que tienen un papel en la biogénesis de las mRNPs y en particular en la helicasa UAP56/DDX39B perteneciente a la familia de helicasas DEAD/H box. Esta proteína, además de desempeñar un papel en el acoplamiento del madurosoma (spliceosome), interviene en la interfaz de la transcripción con la biogénesis y transporte de mRNPs. En concreto, UAP56 interacciona con el complejo THO, involucrado en la formación de la mRNP, y promedia el transporte de la mayoría de los mRNAs a través del reclutamiento del factor ALY/REF. El silenciamiento de UAP56 genera una alta inestabilidad genética en las células. Esto se atribuye a defectos en la formación de la mRNP, pero se desconoce si este fenotipo está mediado por R loops. En la presente tesis hemos querido profundizar en los mecanismos por los cuales UAP56 contribuye al mantenimiento de la integridad del genoma. Hemos corroborado que el silenciamiento de UAP56 causa inestabilidad genética, determinada por un incremento de roturas en el ADN y descubierto nuevos fenotipos asociados, como defectos en la replicación. Además, hemos desvelado que tanto la inestabilidad como los defectos en replicación están mediados por R loops. En colaboración con el laboratorio del Dr. Patrick Sung en la Universidad de Yale, hemos descubierto que UAP56 es una helicasa de ADN-ARN capaz de resolver R loops in vitro. In vivo, la sobreexpresión de UAP56 suprime los fenotipos de inestabilidad mediados por R loops característicos de diversos mutantes, confirmando su actividad helicasa. Por último, hemos determinado en todo el genoma las regiones más propicias a acumular R loops y a donde se une preferentemente UAP56, así como el transcriptoma resultante tras el silenciamiento de UAP56. Debido al creciente número de estudios que relacionan el silenciamiento de diferentes helicasas de la familia DEAD/H box con la acumulación de R loops, hemos comparado a nivel de todo el genoma los sitios de acumulación de R loops tras el silenciamiento de UAP56 y otra helicasa de la misma familia, DDX5, para investigar si ambas proteínas presentan una actividad redundante. Finalmente, hemos estudiado la contribución del factor de transcripción Snail1 a la integridad del genoma. Tradicionalmente, el estudio de esta proteína se ha enmarcado en el contexto de la transición epitelio-mesenquima (EMT), gracias a la cual las células epiteliales adquieren las características propias de las células mesenquimales como la pérdida de los contactos intracelulares e interacción con la membrana basal. Aunque, este proceso es esencial para el desarrollo, se ha demostrado que se activa de manera anormal en los procesos cancerosos. Su activación permite a las células adquirir una mayor capacidad de invasión y metástasis. Un factor crucial encargado de desencadenar el inicio de esta transición es Snail1. En este trabajo hemos demostrado que el silenciamiento de Snail1 causa inestabilidad genética y defectos en la replicación mediados por R loops. Estos datos son particularmente relevantes al sugerir que pueda existir una posible conexión entre los R loops y la inestabilidad asociada a cáncer, dado el papel de Snail1 en determinados procesos cancerígenos.