Requerimientos de secuencia para la replicación y la encapsidación de minigenomas derivados del coronavirus de la gastroenteritis porcina transmisible

Zusammenfassung

El Coronavirus de la Gastroenteritis Porcina Transmisible (TGEV) es un miembro de la familia Coronaviridae, constituida por virus con genomas RNA de polaridad positiva. La replicación y la encapsidación del genoma de TGEV, de 28.5 kb, es un proceso específico basado en el reconocimiento de secuencias conteniendo las señales de replicación y encapsidación. Las señales de RNA en cis son reconocidas por proteínas virales y factores del hospedador. Para identificar señales de replicación y encapsidación actuando en cis, se analizó el rescate por un virus complementador de RNAs defectivos interferentes o minigenomas. El minigenoma más pequeño derivado de TGEV eficientemente rescatado en cultivos incluía 2144 nt en el extremo 5' y 494 nt en el extremo 3'. Para determinar la mínima secuencia 5' requerida para el rescate, se generó una colección de minigenomas con deleciones progresivas en el extremo 5'. El minigenoma más pequeño rescatado contenía en el extremo 5' los primeros 1150 nt del genoma de TGEV. La replicación de los minigenomas se analizó en pase P0 como el incremento en los niveles del RNA producidos por la RNA polimerasa viral sobre los tránscritos generados por la RNA pol II, que reconoce el promotor de CMV bajo el que se expresa el genoma defectivo. También en este caso se encontró que 1150 nt eran la mínima secuencia requerida para la replicación, por lo que los resultados de rescate estaban fundamentalmente influenciados por la ausencia o presencia de secuencias requeridas para la replicación. Para evaluar la encapsidación del RNA, las secuencias derivadas del extremo 5' del minigenoma M26, potencialmente responsables de la encapsidación, se transcribieron utilizando tres sistemas diferentes: (i) el minigenoma M39, (ii) un virus TGEV recombinante o (iii) el replicón del virus Sindbis. En todos los casos se estudió la encapsidación de las secuencias de RNA. En el sistema del replicón de Sindbis la amplificación de los R