Diseño de vectores basados en genomas de coronavirusEstabilidad y modulación de la respuesta inmune innata

Resum

Los coronavirus (CoVs) son virus con un genoma de RNA de cadena sencilla y polaridad positiva. Estos virus son prometedores sistemas de expresión de genes heterólogos para su uso como vectores vacunales dado que expresan altos niveles de las proteínas heterólogas y promueven inmunidad secretora y sistémica. Sin embargo, su uso se ve limitado por la alta tasa de recombinación en CoVs, que causa inestabilidad en los vectores, resultando en la pérdida de los genes heterólogos. El virus de la gastroenteritis porcina transmisible (TGEV) se usó como vector para la expresión de dominios antigénicos de proteínas del virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV). La estabilidad de estos vectores se analizó sistemáticamente para determinar la relevancia en la estabilidad del vector de factores como el tamaño del inserto heterólogo o los niveles de expresión de la proteína. Se consiguieron vectores estables que expresaban dominios antigénicos de pequeño tamaño de las proteínas del PRRSV. Asimismo, se utilizó la proteína M del PRRSV, cuya expresión con vectores basados en el genoma del TGEV fue totalmente estable, como matriz para la exposición de pequeños dominios antigénicos. La reducción en el tamaño del inserto heterólogo y el empleo de la proteína M del PRRSV como matriz resultaron estrategias útiles para la obtención de vectores estables basados en el genoma del rTGEV. La inmunización de lechones con estos vectores indujo protección parcial frente a los signos clínicos de la enfermedad después del desafío con una cepa virulenta del PRRSV. Por otra parte, la proteína no estructural 14 (nsp14) se estudió como posible diana para la atenuación y modulación de la respuesta inmune innata de los vectores derivados de CoVs. La proteína nsp14, codificada en el gen de la replicasa, es una proteína de 60 KDa que forma parte del complejo de replicación-transcripción. La proteína nsp14 es bifuncional, con actividad exonucleasa (ExoN) y guanina- N7-metiltransferasa (N7-MTasa). La actividad ExoN hidroliza RNA de cadena sencilla y doble, y actúa como sistema de corrección de errores, responsable de la alta fidelidad de la replicación de CoVs. La actividad N7-MTasa está implicada en la síntesis del 5’cap, requerido para la traducción y para evitar la activación de la respuesta antiviral. Se generó un conjunto de mutantes en distintos motivos de la proteína nsp14 de TGEV, como modelo de Alfacoronavirus. La mayoría de los mutantes generados mostraron defectos en la síntesis de RNA, con una reducción moderada de la replicación y drástica en transcripción, confirmando un papel esencial de la nsp14 en la síntesis de RNA en CoVs. Los mutantes que carecían de actividad ExoN no fueron viables, a pesar de sintetizar RNAs y proteínas virales. El mutante sin actividad N7-MTasa se rescató, aunque rápidamente aparecían revertientes que se imponían en la población. Una mutación en el motivo zinc finger 1 (ZF-C) produjo un virus viable con cinéticas de crecimiento y síntesis de RNA similares a las del virus silvestre. El virus mutante rTGEV-ZF-C producía un efecto citopático y apoptosis menores que los del virus parental. La acumulación de RNA de doble cadena (dsRNA) en la infección con el virus rTGEV-ZF-C fue significativamente menor que en el caso del virus parental, y por consiguiente inducía una reducida respuesta antiviral. La evaluación de diversas etapas de la respuesta antiviral mostró que la expresión de IFN-β, TNF, y genes estimulados por interferón (ISGs) era menor en las células infectadas con el rTGEV-ZF-C, en comparación con el virus silvestre. En conjunto, los datos obtenidos indicaron que la proteína nsp14 tiene una función adicional en la modulación de la respuesta inmune innata.