Generación de una adenovirus Ad5/52s pseudotipado con la proteína fiber corta del Ad52 para su caracterización in vitro e in vivo como vector de terapia génica

Résumé

La terapia génica consiste en la manipulación y utilización de material genético para el tratamiento de patologías. No obstante, esta estrategia requiere el uso de vectores de terapia génica para transportar el material genético al tejido diana de forma eficiente. Los vectores de terapia génica más comunes son los basados en el adenovirus humano de serotipo 5 (Ad5), porque, respecto a otros serotipos, el Ad5 tiene como ventaja su bioseguridad y facilidad de producción. Sin embargo, para que una célula sea transducida por el Ad5 ha de expresar un receptor reconocible por el Ad5, principalmente la proteína CAR, al que se une a través de su proteína fiber. El fiber de otros serotipos de adenovirus se une a receptores diferentes, permitiendo así la transducción de tipos celulares alternativos a los transducidos por el Ad5. De esta manera, una de las estrategias utilizadas para obtener un vector Ad5 con el tropismo de un serotipo diferente, es la pseudotipación del adenovirus, que consiste en substituir el fiber del Ad5 por el de otro serotipo. De entre los serotipos de adenovirus humanos, uno de los más recientemente descritos es el Ad52. Este serotipo contiene dos fiber de diferentes longitudes, lo cual es un rasgo compartido con los adenovirus humanos intestinales de la especie F. Como el Ad52 fue identificado a partir de muestras de heces de pacientes con gastroenteritis, se le atribuye también un tropismo intestinal, aunque no se ha podido demostrar. En el caso de los adenovirus de la especie F, su fiber largo reconoce el receptor CAR y, por lo tanto, se asume que su tropismo intestinal es mediado por el fiber corto. Dada la cercanía evolutiva entre el Ad52 y los adenovirus de la especie F, se asume que su fiber largo también reconocerá el receptor CAR, mientras que el fiber corto lo hará a otro receptor, dándole así al virus un tropismo independiente de CAR. Así pues, en esta tesis se ha generado un vector quimérico Ad5 pseudotipado con el fiber corto del Ad52 (Ad5/52s) con la finalidad de estudiar el rol específico de esta proteína fiber y, a la vez, caracterizar este adenovirus como vector de terapia génica. La primera parte de la tesis consiste en la generación del genoma del adenovirus Ad5/52s y la producción del vector, lo que incluye un estudio de su ciclo viral para optimizar la producción. El resultado del ciclo viral indica que éste se encuentra moderadamente retrasado respecto al del Ad5. Una vez producidos los vectores, se comparó su tropismo con el del Ad5 en cultivos in vitro, demostrando que la substitución del fiber comporta un cambio en el tropismo del Ad5 hacia líneas celulares, así como también aumenta su transducción en células de Schwann primarias, aunque no aumenta el tropismo del Ad5 en modelos intestinales in vitro. Ya caracterizado el virus in vitro, se demostró que el fiber corto del Ad52 no tiene afinidad por el receptor CAR, y su unión al receptor es dependiente del dominio knob del fiber. Posteriormente, el estudio comparativo de su distribución in vivo por administración intravenosa respecto al Ad5, mostró que el Ad5/52s tan solo transduce ligeramente pulmón a pesar de no ser secuestrado en hígado. Una vez descartados problemas de estabilidad, se observó que la baja eficiencia de infección del Ad5/52s se debe a una mayor inactivación de este virus en sangre, probablemente por la interacción con algún factor plasmático como la trombina. Finalmente, se modificó el fiber corto para limitar esta interacción, lo que permitió aumentar la supervivencia del Ad5/52s en sangre.