Inhibición de la lisil oxidasa por tnf-alfa y ldl en células endotelialesimplicación de la vía de síntesis de isoprenoides

Zusammenfassung

El objetivo de esta tesis ha sido caracterizar la regulación de la lisil oxidasa (LOX) por una citoquina pro-inflamatoria, el TNF-alfa en células endoteliales, así como estudiar el efecto de las estatinas en la regulación de este enzima por parte de esta citoquina y las LDL (lipoproteínas de baja densidad). Además se ha expresado LOX recombinante en E.coli para su caracterización bioquímica. Pare conseguir estos objetivos se han llevado a cabo diversos estudios en células endoteliales de diverso origen (humanas, porcinas y bovinas) tratadas con TNF-a y LDL en presencia de diversos inhibidores y el tratamiento con estinas. De los resultados obtenidos se ha podido concluir que el tratamiento con esta citoquina reduce los niveles de ARN mensajero de la LOX así como los niveles de proteína y de actividad. Además se ha determinado que la regulación de este enzima por el TNF-a requiere la activación del receptor 2 del TNF y que dicha activación se produce mediante un mecanismo transcripcional dependiente de la vía de PKC. Por otro lado, el tratamiento con estatinas, un fármaco hipolipemiante, previene la inhibición de la LOX causada tanto por el TNF-a como por las LDL en células endoteliales. Este efecto se produce a través de la inhibición de la vía de RhoA/ROCK mediante un mecanismo transcripcional. Además, estos fármacos normalizan la expresión endotelial de la LOX en el modelo porcino inhibido de hipercolesterolemia, siendo un efecto independiente del erecto hipolipemiante de estos fármacos. Para la caracterización bioquímica de la LOX, se ha sobre expresado esta proteína acoplada a la tiorredoxina en bacterias origami para permitir su solubilización. Tras su purificación se han determinado varios parámetros como la temperatura o el pH óptimo así como cinéticas de actividad. También se ha determinado la formación conecta del grupo funcional del enzima mediante la tinción especifica de dicho grupo o la reacción con un compuesto que se une específicamente a este. Así se ha podido determinar que la expresión de la LOX fusionada con la tiorredoxina permite la producción de la proteína recombinante soluble y enzimáticamente activa. Además se ha determinado que los aniones inhiben la actividad del enzima de una manera dependiente del radio del anión.