Estudio de la regulacion del splicing en saccharomyces cerevisiaerpl30 como modelo

Resumo

Aunque se han descrito muchos de los componentes del spliceosoma, no en todos los casos se conoce su función y regulación. Para contribuir a este conocimiento el objetivo de esta tesis ha sido el estudio de los mecanismos moleculares involucrados en la regulación del splicing. Para esto se ha utilizado la levadura (S. cerevisiae) como modelo de trabajo y el gen RPL30 como uno de los casos más conocidos de regulación de splicing en levadura. El pre-mRNA RPL30 contiene un intrón único que debe eliminarse mediante splicing para producir posteriormente proteína L30. L30 puede autorregular su propia expresión cuando hay exceso de L30 inhibiendo el splicing de su propio pre-mRNA. Para inhibir el splicing L30 se une a una estructura secundaria -k-turn-del pre-mRNA. Se han obtenido diferentes mutantes en la regulación del splicing de RPL30 mediante screenings genéticos diseñados en esta tesis. En todos se han realizado diferentes análisis genéticos, moleculares y bioquímicos. El primer grupo de mutantes caracterizado comprende mutantes de L30, los cuales han disminuido la inhibición de splicing porqué tienen diferentes mutaciones en la misma secuencia endógena RPL30. Algunas han dado lugar a mutaciones puntuales proteicas que no permiten la interacción con su propio RNA para inhibir el splicing, las cuales explicarían la pérdida de regulación por L30. Otro grupo de mutantes caracterizado es el de los mutantes llamados DIS, también con disminución de inhibición de splicing. Éstos no contienen mutaciones a nivel de la secuencia RPL30 endógena. Actualmente se están clonando en el laboratorio utilizando una nueva estrategia derivada de la descrita en esta tesis. Los mutantes IIS constituyen el grupo de mutantes que han resultado incrementar la inhibición de splicing por L30. Diferentes mutantes IIS corresponden a diferentes mutaciones en Sto1/Cbp80. Cbp80 es componente del complejo de unión a la estructura "cap"5', CBC, incluido en el primer complejo que se forma en el splicing, el "commitment complex (CC)" La mutación de una Pro en lugar de una Leu en uno de los residuos de Cpb80 en el mutante IIS promueve la degradación de la proteína. Esto explica que el fenotipo mutante de IIS5 y el genotipo de la cepa delecionada de CBP80 es similar. En esta tesis se ha propuesto una nueva función para Cbp80 en la regulación del splicing derivada de los resultados obtenido in vivo (ChIP). Cbp80 es necesaria para la incorporación co-transcripcional de U2 snRNP en el gen RPL30. Además Cbp80 puede actuar con sinergia a L30, lo cual explica el fenotipo de hiperregulación observado al delecionar o mutar Cbp80. Otros componentes mutados o delecionados del complejo CC también hiperregulan el splicing de RPL30. Por otro lado, de los resultados in Vitro (Co-Ip) se propone que sin Cbp80 el ensamblaje del spliceosoma se detiene antes de la asociación de la U4/U6.U5 tri-snRNP.