Nuevos métodos para el diagnóstico microbiológicode la neumonía

Résumé

La neumonía es una de las principales causas de mortalidad a nivel mundial y presenta una gran morbilidad asociada. El correcto diagnóstico de esta infección es crucial para el paciente y, en concreto, el diagnóstico microbiológico es esencial para asegurar un tratamiento antibiótico óptimo. Sin embargo, sólo se consigue determinar la etiología en la mitad de los casos aproximadamente, lo que conlleva un tratamiento inadecuado en muchos casos. Por ello, es necesario el desarrollo de nuevas técnicas diagnósticas que permitan un diagnóstico rápido y adecuado de la neumonía. Los objetivos de esta tesis son diseñar y evaluar ensayos basados en la técnica de amplificación de tipo LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) para la identificación de las principales bacterias y virus implicados en la neumonía intrahospitalaria (NIH), incluida la asociada a la ventilación mecánica (NAVM), diseñar y evaluar ensayos basados en la técnica de amplificación de tipo LAMP para la detección de genes de resistencia a antibióticos β-lactámicos en estas bacterias, y evaluar la lipocalina-2 (LCN2) como biomarcador de neumonía. Para cubrir el primer objetivo, se desarrolló y evaluó una LAMP para detectar Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia y Acinetobacter baumannii a partir del ADN extraído mediante un método rápido de muestras de lavado broncoalveolar (LBA), aspirado traqueal (AT) y broncoaspirado (BAS). Además, se desarrolló y evaluó una LAMP para la detección del virus herpes simple-1 (VHS-1) a partir de LBA con y sin extracción de ADN. Por último, se evaluó el papel del citomegalovirus (CMV) en LBA de pacientes críticos y se desarrolló y evaluó una LAMP para su detección. En cuanto al segundo objetivo, se evaluó una LAMP comercial para la detección de genes de resistencia a antibióticos β-lactámicos en Enterobacterales y Acinetobacter spp. tanto a partir de cepas como de muestras respiratorias. Finalmente, como parte del tercer objetivo, se evaluó la utilidad de la LCN2 en plasma y LBA para el diagnóstico de NAVM en un modelo animal porcino. Además, se evaluó la utilidad de la concentración plasmática de LCN2 para determinar la etiología (bacteriana frente a no bacteriana), gravedad y pronóstico de pacientes adultos con neumonía adquirida en la comunidad (NAC) admitidos en Urgencias. La técnica LAMP presentó una elevada sensibilidad y especificidad para detectar los principales microorganismos causantes de NIH (bacterias y virus) de forma barata, rápida, sensible y específica. El sistema comercial basado en LAMP evaluado demostró ser una buena herramienta para la detección de diferentes genes de resistencia a antibióticos β-lactámicos en Enterobacterales así como en Acinetobacter spp. con un tiempo de respuesta rápido. En condiciones de alta concentración de bacterias, el método LAMP presentó buenos resultados cuando se realizó sin un paso previo de extracción de los ácidos nucleicos, reduciendo el tiempo de respuesta. Por otro lado, se observó un aumento de los niveles de LCN2 en los animales que desarrollaban NAVM, especialmente marcado en el LBA. La capacidad de la LCN2 como biomarcador para discriminar la etiología de la NAC fue limitada, pero la concentración de LCN2 se asoció con la gravedad y el ingreso en la Unidad de Cuidados Intensivos en pacientes adultos con NAC. Los trabajos incluidos en esta tesis doctoral podrían contribuir a la mejora del diagnóstico precoz, manejo e identificación de especies causantes de neumonía y, por tanto, al tratamiento óptimo que permitiría la reducción de la morbi-mortalidad asociada.