Regulació de la ciclina g1 i control del cicle cel.Lular de saccharomyces cerevisae

Resumen

Summary The G1 cyclin Cln3 is a key activator of cell cycle entry and plays an essential role linking cell growth and proliferation in budding yeast. The Cln3 cyclin is a low abundant and very unstable protein whose levels respond very rapidly to nutritional changes by different regulatory mechanisms, allowing the cell to adjust proliferation requirements to a changing environment. However, Cln3 expression is not sharply regulated through the cell cycle and it is already present in early G1 cells. Thus, when nutritional and other external signals are kept constant, post-translational mechanisms must exist that withhold the activity of Cln3 cyclin until a critical cell size is reached at Start. We first show that Whi3, a key factor that binds the CLN3 mRNA and exerts a negative role on Cln3, interacts with the cyclin-dependent kinase Cdc28 and regulates its localization in the cell. Efficient interaction with Cdc28 depends on an N-terminal domain of Whi3 that is also required for cytoplasmic localization of Cdc28 and for proper regulation of G1 length. Both Cln3 and Cdc28 are mainly cytoplasmic during early G1, and become nuclear in late G1. However, Whi3-deficient cells show a distinct nuclear accumulation of Cln3 and Cdc28 already in early G1. Second, and as the central part of this work, we have discovered that Cln3 is retained bound to the ER in early G1 cells. ER retention requires binding of Cln3 to Cdc28, a fraction of which also associates to the ER. Cln3 contains a chaperone-regulatory Ji domain that counteracts Ydj1, a J-chaperone essential for ER release and nuclear accumulation of Cln3 in late G1. Finally, Ydj1 is limiting for release of Cln3 and timely entry into the cell cycle. As protein synthesis and ribosome assembly rates compromise chaperone availability, our work led us to hypothesize that Ydj1 may transmit growth capacity information to the cell cycle for setting efficient size/ploidy ratios. Finally, we have analyzed the function of Whi3 as a regulator of filamentous growth. Emerging buds in Whi3-deficient cells are considerably rounder than in wild-type cells, indicating that Whi3 is required to maintain apical growth during S phase. Cdc28 did not properly accumulate at the bud tip during S phase in whi3 cells, and their elongation defects were suppressed by CLN2 overexpression, suggesting a positive function for Whi3 in a Cdk-cyclin-dependent step required for apical growth. Additionally, the actin cytoskeleton was perturbed in Whi3-deficient cells, and WHI3 showed genetic interactions with actin patch components. We propose that Whi3 is required for the apical localization of Cln1,2-Cdc28 complexes during bud growth, a key event in filamentous growth. Resum La ciclina de G1 Cln3 és un activador clau de l'entrada en cicle cel.lular, i juga un paper essencial en la coordinació entre creixement i cicle cel.lular en el llevat de gemmació Saccharomyces cerevisiae. Cln3 és una proteïna poc abundant dins la cèl.lula i els seus nivells responen ràpidament a canvis nutricionals gràcies a diferents mecanismes de regulació, que permeten a la cèl.lula adaptar el seu cicle cel.lular a un entorn canviant. No obstant, l'expressió de Cln3 no està marcadament regulada durant el cicle cel.lular, i la proteïna és ja present a l'inici de la fase G1. Per tant, quan les condicions externes es mantenen constants, han d'existir mecanismes de regulació post-traduccionals que mantinguin retinguda l'activitat Cln3 fins que la cèl.lula aconsegueixi un volum crític necessari pel pas d'Start. En primer lloc mostrem com Whi3, una proteïna que uneix l'mRNA de CLN3 i exerceix un paper negatiu sobre Cln3, interacciona també amb Cdc28 i en regula la localització dins la cèl¿lula. La interacció eficient entre Whi3 i Cdc28, depèn d'un domini N-terminal present en Whi3. Aquest domini és també necessari per a la correcta localització citoplasmàtica de Cdc28 i una correcta regulació de la durada de G1. En segon lloc, com a part central d'aquest treball, mostrem com Cln3 és retinguda al reticle endoplasmàtic a l'inici de la fase G1. Per a la retenció en el reticle endoplasmàtic és necessària la unió de Cln3 a Cdc28, una fracció del qual també es troba associada al reticle endoplasmàtic. Cln3 conté un domini Ji, una variant inhibidora del domini J de xaperones de la família Hsp40. Aquest domini interacciona amb Ydj1, una xaperona de la família Hsp40 de S. cerevisiae, necessària al seu torn per a l'alliberament del reticle endoplasmàtic i l'acumulació nuclear de Cln3 que es dóna a final de la fase G1. Mostrem com Ydj1 és limitant per a l'alliberament de Cln3 del reticle endoplasmàtic i per l'entrada en cicle cel.lular. Ja que la síntesi de proteïnes i l'assemblatge de ribosomes comprometen la disponibilitat d'activitat xaperona, el nostre treball permet hipotetitzar que Ydj1 podria transmetre informació sobre la capacitat de creixement a la maquinària de cicle per tal d'ajustar correctament els ratis entre volum i ploidia. Finalment hem analitzat la funció de Whi3 com regulador del creixement pseudohifal. Les noves gemmes de cèl.lules deficients per Whi3 són significativament més arrodonides que en les cèl.lules salvatges, i això indica que Whi3 és necessari per al manteniment del creixement apical durant la fase S. Cdc28 no s'acumula correctament en la punta de la gemma durant la fase S de cèl¿lules deficients en Whi3; els defectes d'elongació que presenten aquestes gemmes són suprimits per la superexpressió de CLN2, suggerint que Whi3 té una funció positiva en la via necessària per al creixement apical i depenent de l'activitat de complexos ciclina-Cdk. A més, el citoesquelet d'actina està afectat en cèl.lules deficients per Whi3. WHI3 també interacciona genèticament amb certs components del patch d'actina. Proposem que Whi3 és necessari per a la localització apical de complexes Cln1,2-Cdc28 durant el creixement apical de la gemma, un pas clau pel creixement filamentós.