Relevancia del motivo PBM de la proteina E en la replicación y virulencia de los coronavirus

Resumo

Los tres coronavirus (CoV) mortales para las personas (SARS-CoV, MERS-CoV y SARS-CoV-2) han infectado hasta este momento (Diciembre del 2021) entorno a ocho mil, dos mil seiscientos y 262 millones de personas, causando la muerte del 10%, 37% y 2% de las mismas, respectivamente, por lo que su implicación en la salud, es muy importante. Estos CoVs tienen proteínas con actividad canal iónico (viroporinas) que poseen además un motivo PBM de unión a dominios celulares PDZ. Estos se encuentran en más de 400 proteínas celulares por lo que las proteínas con motivos PBM tienen un alto potencial para modificar el comportamiento celular. En esta tesis se ha estudiado la relevancia de las viroporinas 3a y E del SARS-CoV en su viabilidad, y la implicación del motivo PBM de la proteína E de varios CoVs humanos (hCoVs), virulentos o atenuados, en la patogénesis inducida por estos virus. Se ha mostrado que existe una complementación funcional y jerárquica entre los motivos PBM de las proteínas 3a y E del SARS-CoV. Por otro lado, se han generado por genética reversa variantes del SARS-CoV, MERS-CoV y SARS-CoV-2 que carecen de los motivos PBM de la proteína E y se ha analizado su patogenicidad en ratones. Se ha mostrado que los motivos PBM de estos tres hCoV son factores de virulencia y participan en su replicación. Además, se ha construido una colección de mutantes del SARS-CoV en la que el dominio PBM de la proteína E se reemplazó por el motivo PBM de la proteína E de hCoVs virulentos o atenuados, y se analizó su virulencia. Se observó un gradiente de su patogenicidad, dependiendo de si el dominio PBM presente se derivaba de un hCoV virulento o atenuado. Se analizó el patrón de expresión génica asociado a los distintos motivos PBM en pulmones de ratones infectados con el SARS-CoV mediante secuenciación masiva de los mRNA expresados en los pulmones de estos ratones, y se observó que el motivo PBM de la proteína E del SARS-CoV y SARS-CoV-2 desregula la expresión de genes relacionados con el transporte iónico y la homeostasis celular. En concreto, disminuyeron la expresión del mRNA del regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR), que es esencial para la resolución del edema. La disminución del CFTR se asoció con una mayor acumulación de edema en los pulmones de los ratones infectados con SARS-CoV que incluye motivos PBM. Se estudió el efecto de los compuestos que modulan la expresión y actividad del CFTR en la replicación del SARS-CoV y SARS-CoV-2 en cultivos celulares y se observó que estos compuestos reducen drásticamente la producción del SARS-CoV-2 y, de forma más modesta, la del SARS-CoV. El motivo PBM de la proteína E del SARS-CoV se une al dominio PDZ celular de la sintenina y promueve la patogénesis del virus. La relevancia de los residuos del motivo PBM y de otros aminoácidos, que se encuentran hacia el extremo amino terminal del mismo, se determinó utilizando un modelo in silico de la interacción PBM-PDZ. Basándonos en este modelo, se diseñó un conjunto de recombinantes del SARS-CoV con mutaciones que afectan a los residuos potencialmente relevantes en esta interacción. Los residuos del motivo central del PBM tenían un mayor impacto en la patogénesis del SARS-CoV que los ubicados hacia el extremo amino terminal de este dominio. Estos resultados mostraron la alta relevancia del motivo PBM en la replicación y virulencia de los CoVs, y han permitido la identificación de dianas celulares para la selección de antivirales.