Caracterización de complejos cdk-ciclina atípicos humanos

Laburpena

La desregulación en los mecanismos de control del ciclo celular es un evento indiscutiblemente asociado a la aparición de diversas patologías, entre las que destacan los procesos tumorales. Como principales reguladores del ciclo celular, las CDKs y ciclinas tienen un papel central en este tipo de procesos, de forma que es de vital importancia conocer los mecanismos responsables de esta desregulación. Dentro de las amplias familias de CDKs y ciclinas, el conocimiento acerca de la regulación de, y los procesos regulados por el pequeño grupo de las consideradas de ciclo celular (CDKs 1, 2, 4 y 6, y ciclinas A, B, D y E) ha proporcionado un marco para el entendimiento de los procesos reguladores del ciclo. Pero la gran ampliación a lo largo de la evolución de estas proteínas parece indicativa de la necesidad de un aumento en el grado de control del ciclo celular, ya sea en determinados tejidos o momentos del desarrollo, o frente a situaciones patológicas como el cáncer. Los miembros más recientes de la familia de las ciclinas se consideran, en su gran mayoría, atípicos. Estas ciclinas atípicas se caracterizan por poseer tan solo una caja de ciclina y, en general, sus funciones no se encuentran completamente establecidas y ni tan siquiera se sabe si forman complejo con alguna CDK. Ampliar el poco conocimiento que se tiene acerca de estas proteínas debería poder ayudar a entender cómo las mismas encajan en el marco establecido del control del ciclo celular. Por este motivo, el objetivo principal del trabajo que aquí se presenta consiste en el estudio de las redes de interacción en que participan las nuevas CDKs y las ciclinas atípicas. Este objetivo general fue dividido en dos objetivos específicos: por un lado, la identificación de nuevos complejos CDK-Ciclina atípicos humanos y, por otro lado, la identificación de sustratos de dichos complejos. Para la identificación de nuevos complejos CDK-Ciclina, se llevaron a cabo, de forma paralela, dos estrategias diferentes. La primera consistió en el estudio del interactoma de las ciclinas CCNI, CNTD2, CCNG1 y CCNG2 a través de experimentos de trapping sobre extractos de tejido cerebral de rata acoplados a la detección de interactores mediante espectrometría de masas. Este sistema no permitió identificar con seguridad ninguna CDK asociada a las ciclinas de interés, en cambio, una serie de potenciales interactores fueron detectados y posteriormente validados mediante otros métodos. Estos interactores tienen funciones relevantes en tejido nervioso, lo que hará muy interesante su estudio en un futuro, en lo que constituyen nuevas posibles líneas de investigación para nuestro grupo. La otra estrategia llevada a cabo consistió en un screening dirigido basado en un ensayo de doble híbrido en levadura. Este método permitió detectar un total de 17 interacciones, de las cuales 7 han sido previamente reportadas por otros grupos de investigación, mientras que 10 de ellas constituyen potenciales nuevos complejos CDK-ciclina. Tres de las interacciones, las consistentes en los complejos CDK16-SPY1, CDK6-CCNI y CDK16-CCNY, fueron seleccionadas para su validación mediante otros métodos. La interacción entre CDK16 y SPY1, aunque reportada por otro grupo de investigación al mismo tiempo que este trabajo comenzaba, no había sido validada mediante otros sistemas. En el presente estudio, dicha interacción fue demostrada, tanto in vitro como in vivo, mediante ensayos de trapping e inmunoprecipitación, respectivamente, seguidos por detección mediante Western Blot. Además, a través de ensayos de fosforilación in vitro, usando proteínas expresadas y purificadas a partir de bacterias, también se comprobó que dicho complejo es activo, ya que CDK16 es capaz de fosforilar a SPY1 y de autofosforilarse en presencia de la misma. En referencia al complejo CDK6-CCNI, también dicha interacción fue confirmada mediante un ensayo de trapping seguido de Western Blot. Sin embargo, en este caso no ha sido posible demostrar la actividad del complejo con el uso de proteínas purificadas a partir de bacterias. En cuanto a la pareja CDK16-CCNY, tanto su interacción como su actividad han sido demostradas por diversos estudios. A pesar de que dicho complejo tiene, de hecho, funciones establecidas, hasta el momento no se conocía ningún sustrato del mismo. En el presente trabajo, en lo que constituye el segundo objetivo específico, se identificaron potenciales sustratos del complejo CDK16-CCNY. Para ello, se siguieron dos estrategias complementarias: la identificación de interactores de CCNY y la identificación de sustratos específicamente fosforilados por el complejo CDK16-CCNY. Mediante estos sistemas se detectó a la proteína PRC1, y mediante ensayos de fosforilación in vitro, se comprobó que ésta es fosforilada por el complejo. De este modo, se ha identificado a PRC1 como el primer sustrato bona fide del complejo CDK16-CCNY.La desregulación en los mecanismos de control del ciclo celular es un evento indiscutiblemente asociado a la aparición de diversas patologías, entre las que destacan los procesos tumorales. Como principales reguladores del ciclo celular, las CDKs y ciclinas tienen un papel central en este tipo de procesos, de forma que es de vital importancia conocer los mecanismos responsables de esta desregulación. Dentro de las amplias familias de CDKs y ciclinas, el conocimiento acerca de la regulación de, y los procesos regulados por el pequeño grupo de las consideradas de ciclo celular (CDKs 1, 2, 4 y 6, y ciclinas A, B, D y E) ha proporcionado un marco para el entendimiento de los procesos reguladores del ciclo. Pero la gran ampliación a lo largo de la evolución de estas proteínas parece indicativa de la necesidad de un aumento en el grado de control del ciclo celular, ya sea en determinados tejidos o momentos del desarrollo, o frente a situaciones patológicas como el cáncer. Los miembros más recientes de la familia de las ciclinas se consideran, en su gran mayoría, atípicos. Estas ciclinas atípicas se caracterizan por poseer tan solo una caja de ciclina y, en general, sus funciones no se encuentran completamente establecidas y ni tan siquiera se sabe si forman complejo con alguna CDK. Ampliar el poco conocimiento que se tiene acerca de estas proteínas debería poder ayudar a entender cómo las mismas encajan en el marco establecido del control del ciclo celular. Por este motivo, el objetivo principal del trabajo que aquí se presenta consiste en el estudio de las redes de interacción en que participan las nuevas CDKs y las ciclinas atípicas. Este objetivo general fue dividido en dos objetivos específicos: por un lado, la identificación de nuevos complejos CDK-Ciclina atípicos humanos y, por otro lado, la identificación de sustratos de dichos complejos. Para la identificación de nuevos complejos CDK-Ciclina, se llevaron a cabo, de forma paralela, dos estrategias diferentes. La primera consistió en el estudio del interactoma de las ciclinas CCNI, CNTD2, CCNG1 y CCNG2 a través de experimentos de trapping sobre extractos de tejido cerebral de rata acoplados a la detección de interactores mediante espectrometría de masas. Este sistema no permitió identificar con seguridad ninguna CDK asociada a las ciclinas de interés, en cambio, una serie de potenciales interactores fueron detectados y posteriormente validados mediante otros métodos. Estos interactores tienen funciones relevantes en tejido nervioso, lo que hará muy interesante su estudio en un futuro, en lo que constituyen nuevas posibles líneas de investigación para nuestro grupo. La otra estrategia llevada a cabo consistió en un screening dirigido basado en un ensayo de doble híbrido en levadura. Este método permitió detectar un total de 17 interacciones, de las cuales 7 han sido previamente reportadas por otros grupos de investigación, mientras que 10 de ellas constituyen potenciales nuevos complejos CDK-ciclina. Tres de las interacciones, las consistentes en los complejos CDK16-SPY1, CDK6-CCNI y CDK16-CCNY, fueron seleccionadas para su validación mediante otros métodos. La interacción entre CDK16 y SPY1, aunque reportada por otro grupo de investigación al mismo tiempo que este trabajo comenzaba, no había sido validada mediante otros sistemas. En el presente estudio, dicha interacción fue demostrada, tanto in vitro como in vivo, mediante ensayos de trapping e inmunoprecipitación, respectivamente, seguidos por detección mediante Western Blot. Además, a través de ensayos de fosforilación in vitro, usando proteínas expresadas y purificadas a partir de bacterias, también se comprobó que dicho complejo es activo, ya que CDK16 es capaz de fosforilar a SPY1 y de autofosforilarse en presencia de la misma. En referencia al complejo CDK6-CCNI, también dicha interacción fue confirmada mediante un ensayo de trapping seguido de Western Blot. Sin embargo, en este caso no ha sido posible demostrar la actividad del complejo con el uso de proteínas purificadas a partir de bacterias. En cuanto a la pareja CDK16-CCNY, tanto su interacción como su actividad han sido demostradas por diversos estudios. A pesar de que dicho complejo tiene, de hecho, funciones establecidas, hasta el momento no se conocía ningún sustrato del mismo. En el presente trabajo, en lo que constituye el segundo objetivo específico, se identificaron potenciales sustratos del complejo CDK16-CCNY. Para ello, se siguieron dos estrategias complementarias: la identificación de interactores de CCNY y la identificación de sustratos específicamente fosforilados por el complejo CDK16-CCNY. Mediante estos sistemas se detectó a la proteína PRC1, y mediante ensayos de fosforilación in vitro, se comprobó que ésta es fosforilada por el complejo. De este modo, se ha identificado a PRC1 como el primer sustrato bona fide del complejo CDK16-CCNY.