Estudis in vivo d’internalització cel•lular de nucleòsids fluorescents

Résumé

Els anàlegs nucleosídics poden ser utilitzats com a fàrmacs anticancerígens i en teràpies antivirals. Les proteïnes encarregades del reconeixement i translocació dels derivats cap a l'interior cel•lular són els transportadors nucleosídics (NTs), els quals es classifiquen en transportadors de nucleósids concentratius (CNTs) i equilibratius (ENTs), i els transportadors de cations orgànics (OCTs). La utilització de compostos marcats radioactivament és habitual en l'estudi de l'activitat d'aquestes proteïnes, tot i que aquest tipus d'assaig no permet l'anàlisi del transport intracel•lular o la distribució dels nucleòsids a l'interior cel•lular. Per aquest motiu, l'objectiu del present treball és l'obtenció d'anàlegs nucleosídics fluorescents que permetin l'estudi de l'activitat dels transportadors CNT i OCT in vivo mitjançant microscòpia confocal de fluorescència. Els compostos fluorescents triats per a l'estudi s'escullen en funció de la seva estructura (amb modificacions mínimes respecte als nucleòsids naturals) i característiques espectroscòpiques (longitud d'ona mínima d'absorció de 350 nm). Segons aquests criteris es trien cinc anàlegs: pirrolo-Citidina (pirrolo-C), Uridina-furà (U-furà), derivat tricíclic de citidina (tC), derivat de pteridina i anàleg amb un grup benzotiofé. A excepció del primer anàleg (compost comercial), els derivats són sintetitzats i purificats per HPLC. La interacció de les molècules amb les proteïnes CNT i OCT es determina mitjançant la inhibició del transport de [(3)H]Uridina o [(3)H]MPP+ en cèl•lules HeLa transfectades transitòriament. Per altra banda, experiments d'electrofisiologia utilitzant oòcits de Xenapus laevis que expressaven una determinada proteïna CNT permeten avaluar la internalització dels derivats. l'estudi in vivo del transport dels anàlegs fluorescents realitza mitjançant microscòpia confocal de fluorescència amb una longitud d'ona d'excitació de 350 nm. Els derivats nucleosídícs fluorescents pirrolo-C i U-furà, presenten una forta interacció amb els transportadors hCNT1 i hCNT3, amb unes ICsD de l'ordre baix i inhibeixen significativament l'activitat de hOCT1 i hOCT2. Segons els resultats dels assajos d'electrofisiologia, tant pirrolo-C com U-furà poden ser internalitzats pels dos transportadors concentratíus. El compost tC inhibeix l'activitat tant de hCNT2 com de hCNT3 amb una baixa afinitat, però no indueix corrents de sodi en oòcits en els estudis d'electrofisiologia. Finalment, els derivats de pteridina i benzotiofé no mostren cap tipus d'interacció amb els transportadors. Els experiments in vivo utilitzant microscòpia confocal de fluorescència mostren una clara acumulació intra cel•lular de U-furà i pirrolo-C.